ELISA实验核心知识点总结

一、基本原理

抗原-抗体特异性结合

利用抗原与抗体的高亲和力结合特性，形成稳定复合物（如病毒蛋白与特异性IgG抗体）。

酶标记信号放大：酶（如HRP、AP）标记抗体或抗原，催化底物显色（如TMB显蓝色），吸光度与目标物浓度成正比。

定量依据：比尔-朗伯定律（A=εcl），通过酶标仪测定450 nm吸光度（OD值）计算浓度。

核心试剂

固相载体：聚苯乙烯微孔板（吸附抗体/抗原）。

标记物：酶标抗体（如HRP-抗人IgG）、酶标抗原。

底物：TMB（HRP常用）、pNPP（AP常用）。

二、实验步骤

包被（Coating）

将捕获抗体/抗原用碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释后加入微孔板，4℃过夜或37℃孵育2小时，形成固相层。

关键点：包被后需倒液避免甩板，防止抗体脱落。

封闭（Blocking）

加入封闭液（5%脱脂奶粉或1% BSA的PBS），覆盖未结合位点，减少非特异性吸附，37℃孵育1-2小时。

注意：封闭剂需覆盖孔底，避免边缘干涸。

加样与孵育

待测样本按梯度稀释后加入孔中，37℃孵育1-2小时。需设置复孔以减少误差。

样本处理：血清需离心去除颗粒物，细胞培养上清需过滤除菌。

酶标二抗孵育

加入HRP标记的二抗（如抗人IgG-HRP），室温避光孵育1小时。二抗需离心去除沉淀。

显色与终止

加入TMB底物溶液，避光反应10-30分钟至阳性孔显蓝色。终止液（2M H₂SO₄）终止反应，颜色转为黄色。

注意：终止后30分钟内完成检测，避免吸光度漂移。

结果读取

使用酶标仪测定450 nm吸光度，绘制标准曲线（常用四参数逻辑回归），计算样本浓度。

三、实验方法类型

双抗体夹心法

应用：检测大分子抗原（如病毒蛋白、细胞因子），灵敏度高（pg级）。

案例：检测HBsAg时，灵敏度达0.1 ng/mL。

间接法

应用：检测抗体（如HIV抗体、疫苗效价评估），灵活性强。

案例：血液筛查中检测HIV抗体，窗口期后准确率＞99%。

竞争法

应用：检测小分子半抗原（如农药残留、激素），适合复杂基质。

案例：检测黄曲霉毒素B1时，线性范围0.25-5.0 ng/mL。

捕获法

应用：检测IgM抗体（如麻疹病毒IgM），避免IgG干扰。

四、关键注意事项

操作规范

加样需精准（微量移液器校准），避免孔壁残留或交叉污染。

洗涤干净（5次PBST洗涤），减少背景干扰。

试剂与仪器

标准品需分装冻存，避免反复冻融导致降解。

酶标仪需定期校准，确保波长准确性（如450 nm±2 nm）。

常见问题与解决

高背景：封闭不足→延长封闭时间；洗涤不干净→增加洗涤次数。

信号弱：抗体失活→验证活性；孵育温度不足→延长至4℃过夜。

假阳性：类风湿因子干扰→样本稀释或使用特异性更高的抗体。

五、应用领域

临床诊断

传染病检测：HIV抗体、乙肝表面抗原（HBsAg）、登革热IgM抗体。

肿瘤标志物：AFP、CEA检测，辅助癌症早期筛查。

食品安全

农药残留：三唑酮、百菌清检测，灵敏度达ng/g级。

毒素检测：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素B1定量分析。

药物研发

药效评估：细胞因子（如IL-6、TNF-α）浓度监测。

疫苗开发：抗体效价测定。

六、实验常见问题

问题现象          可能原因                                            解决方法

空白背景高       洗板不干净、显色液变质                    延长洗板时间，更换显色液2

信号弱或无信号抗体失活、孵育温度不足                   验证抗体活性，延长孵育时间2

假阳性               类风湿因子干扰、交叉反应              使用F(ab')片段标记抗体5

重复性差           加样量不一致、温控不稳定               校准移液器，控制恒温箱温度2

七、技术进展

第四代HIV试剂盒

结合抗体与p24抗原检测，窗口期缩短至2周。

化学发光ELISA

采用鲁米诺或吖啶酯标记，灵敏度提升至fg级。

微流控芯片ELISA

集成样本处理、反应、检测于一体，实现POCT（即时检测）。

自动化系统

全自动酶标仪支持高通量检测（如96孔板批量处理），减少人为误差。

八、总结

ELISA凭借其高灵敏度、特异性和操作便捷性，成为生物医学研究及工业检测的核心技术。实验成功的关键在于严格把控操作细节（如封闭、洗涤）、合理选择方法类型（如夹心法检测抗原）以及定期维护仪器（如酶标仪校准）。未来随着微流控、化学发光等技术的融合，ELISA将在快速诊断和现场检测领域发挥更大作用。